Церковь Сант-Андреа в Риме
Сюда из последних сил добрался бежавший из заключения бывший консул Римской республики, а ныне политический преступник Анджелотти. Он прячется в капелле своей сестры маркизы Аттаванти. Художник Каварадосси работает над изображением Марии Магдалины. Ризничий возмущен тем, что она начинает напоминать одну из прихожанок. Каварадосси отрицает сходство: в мыслях его лишь Тоска, ничьи другие черты не могут появиться под его кистью. После того как Ризничий удаляется из капеллы, показывается Анджелотти. Он знаком с художником и доверяет ему, а потому обращается с просьбой о помощи. Услышав голос Тоски, он прячется снова. Певица замечает сходство Магдалины с маркизой Аттаванти. Это вызывает у Тоски взрыв ревности, но художнику удается ее успокоить. Тоска уходит, а Каварадосси предлагает беглецу спрятаться в его доме. Слышен пушечный выстрел, извещающий о том, что побег раскрыт. Мужчины спешат уйти.
Начинается торжественная служба. Среди молящихся появляются шеф полиции Рима Скарпиа и полицейский агент Сполетта. Их интересует капелла Аттаванти, где они, рассчитывая найти следы беглеца, обнаруживают веер, забытый маркизой, и пустую корзину из-под еды. Увидев возвратившуюся в церковь Флорию Тоску, которая надеялась снова встретиться с любимым, Скарпиа решает использовать ее в своих целях. Он искусно разжигает ревность Флории. Когда же она бросается вон из церкви, Скарпиа посылает за ней полицейских агентов в расчете на то, что разъяренная Тоска приведет их к тайному убежищу художника.
Палаццо Фарнезе
В своем кабинете Скарпиа ждет известий от агентов. Его ожидания оправдались лишь наполовину: Тоска действительно привела их к Каварадосси – и тот схвачен, но Анджелотти найти не удалось. Скарпиа надеется пытками вырвать у художника правду, а Тоску приказывает привести к нему в кабинет. Шеф полиции сам начинает допрашивать Каварадосси, но его усилия тщетны. Появившейся Тоске художник успевает шепнуть, что тайна должна быть сохранена во что бы то ни стало. Его уводят на пытку. Стоны и крики любимого лишают Флорию самообладания, и она открывает секрет тайника в саду. По приказу Скарпиа пытку прекращают. Измученного Каварадосси жандармы швыряют к ногам Тоски. Он слышит распоряжение шефа полиции, из которого становится ясно, что тайна раскрыта. Художник проклинает Тоску. Скарпиа велит увести его и назначает на утро казнь. В ответ на мольбы Тоски он предлагает спасти жизнь Каварадосси: если певица согласится принадлежать ему, то в Каварадосси во время казни будут стрелять холостыми патронами. В присутствии Тоски шеф полиции демонстративно отдает приказ, а затем пишет пропуск для нее и Каварадосси, чтобы они могли покинуть Рим. И Тоска не догадывается, что Скарпиа не собирается выполнять свое обещание спасти жизнь Каварадосси. Однако, когда он пытается овладеть Тоской, она, защищаясь, невольно его убивает. С ужасом глядя на труп Скарпиа, певица осторожно высвобождает из мертвой руки заветный пропуск и выскальзывает из дворца.
Верхняя площадка замка Сант-Анджело
Здесь ждет расстрела Каварадосси. Вбегает Тоска и возбужденно рассказывает, что казнь будет мнимой. Марио лишь должен получше притвориться, чтобы солдаты ничего не заподозрили, а потом они смогут ехать. Входят солдаты. Залп – и художник падает. Тщетно взывает к нему Флория. Понимая, что он мертв, Тоска бросается с парапета вниз.
